الدواجن المعدّلة وراثيّاً

إعداد: أ.د. محمد علي مكي جاسم الربيعي
العراق

لقد كان الدجاج محوراً لأبحاث علم أجنَّة الفقاريات لعقود عدّة، حيث يتمّ تخصيب أجنّته داخليًّا، ثم تحميلها بدقّة في البيض، ممّا يوفّر سهولة الوصول إلى مراحل النمو لإجراء تجارب تلاعبية رائدة. بفضل العديد من التقنيات الناشئة، مثل التثقيب الكهربائي في الجسم الحيّ، وأدوات أبحاث الخلايا الجذعية، والأساليب المبتكرة للحيوانات المعدّلة وراثيًّا، وموارد التسلسل الجينومي التي يمكن الوصول إليها. ففضلاً عن الأساليب التقليدية مثل التطعيم وتتبّع النسب، أصبح جنين الكتكوت الآن أكثر قوّة، ممّا يضيف إلى تاريخها الواسع والملحوظ كنظام نموذجي علمي مهمّ. في الثلاثين عاماً الماضية، فتحت كيانات بحثية متنوّعة الأبواب أمام تطوير الدجاج المعدّل وراثيًّا. إنّ تبنّي الدجاج المعدّل وراثيًّا كنموذج للعديد من مجالات الدراسة، بما في ذلك السلوك، وبيولوجيا النمو، وعلم المناعة، وعلم وظائف الأعضاء، وعلم الأعصاب، قد اكتسب مؤخّراً أهمّية كبيرة في مجتمع أبحاث الطيور.

مع ظهور أدوات تحرير الجينوم، كان هناك مجال متزايد لتطوير دواجن معدّلة وراثيًّا، تكون مقاومة لبعض الأمراض المُعدية. لقد أظهرت الكثير من الأبحاث أنّ جينومات الدجاج المعدّلة وراثيًّا تحمل وعداً هائلاً لتعزيز إنتاج الدواجن، وتوفير محرّك هائل لتكوين البروتين الصناعي. الكائن المعدّل وراثيًّا هو الكائن الذي خضع لتقنيات الهندسة الوراثية لدمج جزء من الحمض النووي لنوع آخر في جسمه. يُقال إنّه تمّ تطوير طرق معدّلة وراثيًّا لإنتاج طيور معدّلة وراثيًّا تعبّر عن البروتينات البشرية المؤتلفة في البيض، وجينات خاصّة بالأنسجة كنموذج للطيور. ويعتقد أنّ تنفيذ الأساليب الفعّالة للكتاكيت المعدّلة وراثيًّا يسهم في التطبيقات الصناعية في تربية الماشية، فضلاً عن توسيع معرفتنا لبيولوجيا الطيور. يبدو أنّ تطوّر السمات الخاصّة بالسلالة في جينوم الدجاج قد تؤثّر بشدّة بالانتقاء الاصطناعي. من المرجّح أنّ يكون الإستيلاد الإنتقائي الإصطناعي، حيث يتمّ اختيار الاختلافات الطبيعية المتفوّقة لتوليد أجيال لاحقة من الكائنات الحيّة بهدف نقل التفوّق إلى الأحفاد، أقدم شكل معروف لتعديل الجينوم الذي أصبح محكوماً وراثيًّا بعد اكتشاف مندل لقانون الوراثة.
إنها شهادة على فعالية الإنتخاب الإصطناعي الكلاسيكي، حيث تمّ تطوير وإنتاج العديد من السلالات ذات السمات المميّزة والمستقرة في جميع أنحاء العالم. لقد أدّى الإستيلاد الإنتقائي إلى تغيير التركيب الوراثي للدجاج للحصول على أنماط ظاهرية، وسمات بيولوجية مواتية، ممّا زاد من قدرته على التكيّف مع بيئات إنتاج محدّدة. وقد أدّى التقدّم في التربية والتكنولوجيا الحيوية إلى تعزيز جهود البحث والصناعة لتعزيز رعاية الحيوان وإنتاجيته. ومع إزدهار زراعة الخلايا الجرثومية، وتحرير الجينوم، والتقنيات المعدّلة وراثيًّا، أصبح تغيير جينوم الدجاج أسهل وأكثر عملية. وقد أدّى هذا إلى طفرة حديثة في استخدام أساليب مختلفة لتحرير الجينوم في الدجاج، والتي يمكن أن تؤدّي إلى عمليات الحذف، والإدراج، واستبدال القواعد. بغرض دراسة الدوائر الجينية، سيكون من المفيد للغاية إنشاء خطوط موارد مصمّمة للجينوم يمكن الوصول إليها بسهولة. تهدف هذه المراجعة إلى تحديد الجوانب المختلفة للدواجن المعدّلة وراثيًّا، وكيفية استخدامها للتحكّم في تخليق البروتينات العلاجية المؤتلفة.
تحرير الجينوم والدواجن المعدّلة وراثيًّا
إنّ تحرير الجينوم مستوحى من الأبحاث التطورية والصحّية. كان الدجاج هو النوع الثاني من الفقاريات بعد الإنسان العاقل الذي حصل على تسلسل الجينوم الخاص به بالكامل، ممّا مكَّن البحث الوراثي الجزيئي باستخدام القوّة الكاملة لعلم الجينوم الحديث. تحرير الجينوم هو تقنية يتمّ، من خلالها، إدخال تعديلات دقيقة على جينوم الكائن الحيّ، من أجل تعزيز الإنتاج الحيواني أو مقاومة الأمراض دون إدخال أي سمات غير مرغوب فيها. تتضمّن أدوات تحرير الجينوم ما يشبه منشّط النسخ.
عزّزت التنمية البشرية من البحوث المعدلّة وراثيًّا، من خلال توليد نماذج غير بشرية تحتوي على تعديلات أكثر تركيزاً ودقّة على الجينوم. بشكل عام، على عكس التربية الإنتقائية التقليدية، التي تستغرق وقتاً طويلاً لإنتاج السمات المرغوبة، لأنّها تعتمد على المتغييرات الجينية الموجودة بشكل طبيعي، يمكن لتقنيات تحرير الجينوم إدخال تغييرات جينية مواتية بسرعة في الجينات المستهدفة. وبالتالي، فإنّ تحرير الجينوم يوفّر تقنية قويّة وآمنة تعمل بشكل جيّد جنباً إلى جنب مع التربية التقليدية لرفع الإنتاج والمناعة ومقاومة الأمراض، وتطوير نماذج حيوانية لإجراء أبحاث تفيد صحّة الإنسان، وحماية الأنواع المحلّية، وتقليل الأمراض المنقولة بالنواقل، وجلب الأنواع المنقرضة بشكل معقول بهدف إحيائها. أدّى ظهور تقنيات تسلسل الجينوم، وتوافر قواعد بيانات جينوم الدجاج التي يمكن الوصول إليها على نطاق واسع، إلى تسريع نمو تربية الدواجن من خلال القدرة على تحرير العلامات الجينية المرتبطة بالإنتاجية عن طريق أنظمة تحرير الجينوم المختلفة.
أصبحت البروتينات المؤتلفة ذات شعبية متزايدة في السنوات الأخيرة، لاستخدامها في المجالات الصناعية والطبّية والعلمية. إنّ توليد البروتين المؤتلف على نطاق واسع يتطلّب مفاعلات حيوية ميكانيكية مكلفة ومعقّدة، ممّا يتيح الفرصة لتصميم حيوانات الماشية كمفاعلات حيوية بديلة بسبب فوائدها المحتملة المتمثّلة في انخفاض التكلفة وارتفاع حجم الإنتاج. المفاعلات الحيوية الحيوانية هي أنظمة حيوانية معدّلة وراثيًّا لديها القدرة على خفض تكاليف التصنيع، وزيادة إنتاجية البروتينات المؤتلفة ذات الأهمّية العلاجية للتغلّب على الأمراض، وتحسين نوعية حياة الإنسان، مع الإستفادة من التطوّرات في الطبّ، ويتيح الوصول إلى قواعد البيانات المختلفة، وأدوات شبكة المعلومات الجينية، ومنتديات المناقشة، وغيرها من الميزات.
إستخدم العديد من الباحثين نماذج حيوانية معدّلة وراثيًّا بما في ذلك الثدييات والطيور، لإنتاج البروتينات المرغوبة في الحليب، أو بياض البيض، أو الدم، أو سوائل الجسم الأخرى. تمّ إنشاء الماعز التي تنتج مضادات الثرومبين في حليبها بواسطة شركة علاجات حيوية، باستخدام محفّز خاصّ بالثدي. كان نموذج الأرنب المعدّل وراثيًّا الذي يفرز بروتيناً دوائيًّا لعلاج الوذمة الوعائية الوراثية في حليبه، هو ثاني نظام مفاعل حيوي حيواني معدّل وراثيًّا وافقت عليه إدارة الغذاء والدواء الأميركية.
ومع ذلك، فإنّ استخدام الطيور كأنظمة مفاعل حيوي له عدد من الفوائد مقارنة بالثدييات التي تتعلّق بالبساطة في الإعداد والقياس، وانخفاض التكاليف، وارتفاع عوائد الإنتاج، وتكلفة تربية الدجاج منخفضة للغاية، وقد تنمو قطعان الطيور الصغيرة بسرعة لتصبح قطعاناً كبيرة. علاوة على ذلك، تنمو أجنّة الطيور في نظام خالٍ من التأثيرات الأمومية، ممّا يجعل تجارب البيض المختلفة ممكنة مع السماح بالتحديد الموثوق للتفاعلات مع تدخّلات الإجهاد الكيميائي أو الفيزيائي. علاوة على ذلك، من الممكن إجراء أنواع عديدة من التحقيقات على الخلايا الحيّة، من خلال التلاعب الجنيني بمرحلة معينّة، مثل العزل والزرع ونقل الجينات. على الرغم من أنّ الجينوم البشري يبلغ ضعف حجم الجينوم في الدجاج، إلاّ أنّه من المعروف أنّ هناك نفس عدد الجينات في الدجاج كما هو الحال في الإنسان. إنّ وضع البيض، وزيادة الوزن، واستقلاب الدهون هي أمثلة على السمات المهمّة تجاريًّا والمتطوّرة في الطيور، والتي يتمّ التحكّم فيها عن طريق المسارات الجينية التي يمكن استغلالها في الأبحاث البشرية من أجل كشف مسبّبات الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك السمنة والشذوذات القلبية الوعائية. عندما يتعلّق الأمر بأبحاث سرطان المبيض البشري، تكون الطيور أكثر فائدة من القوارض أو البشر، لأنّها تضع عدداً كبيراً من البيض طوال حياتها، ولها دورة إباضة قصيرة، ممّا يجعلها أكثر عرضة للإصابة بسرطان المبيض مقارنة بالنماذج الأخرى.
إنّ لدى الدجاجة البياضة قدرة وافرة على تخليق البروتين. فبيضة نموذجية تزن 60 جراماً، وتحتوي على حوالي 3.5 جرام من البروتين في بياض البيض. وقد تضع كل دجاجة أكثر من 300 بيضة سنويًّا، ممّا أثار اهتماماً إضافيًّا باستخدام الدجاج كمفاعلات حيوية. بالإضافة إلى ذلك، فإنّ وفرة العناصر الغذائية النشطة بيولوجيًّا، والبساطة الهيكلية لبروتينات البيض، تجعل الدجاج نظام مفاعل حيوي مثالي. الطبيعة البسيطة نسبيًّا لبروتينات بياض البيض تجعل من السهل تنقية البروتينات المؤتلفة من بروتينات بياض البيض. فحقيقة أنّ عدداً من السكّريات القليلة المرتبطة بالبولي ببتيدات في بروتينات الدجاج يمكن مقارنتها بتلك الموجودة في البشر، أكثر من تلك الموجودة في الثدييات، قد تكون مفيدة لتكييف الدجاج كمفاعل حيوي، على الرغم من ندرة المعلومات حول تعديل الجليكوزيل في الطيور. وبالتالي، يمكن إنتاج البروتينات المؤتلفة ذات الجليكوزيل الشبيه بالإنسان في المفاعلات الحيوية للطيور. على النقيض من غالبية الثدييات الأخرى، لا يمتلك البشر عادةً بروتيناً محدّداً بالجليكوزيل. تمتلك الثدييات، باستثناء الإنسان والرئيسيات، مؤشّرات حيوية لـ (α1-3-galactose α1,3-Gal) على أنسجتها.
إنّ أنزيم (alpha-1,3-galactosyltransferase) غير فعّال في البشر، وحوالي 1٪ من الخلايا الليمفاوية البائية الفعّالة تطلق أجساماً مضادة لـ (α-Gal) كردّ فعل على البكتيريا المعوية، والتي تلتزم برفض الطعوم الأجنبية المزروعة، وتشكّل مضاعفات إذا تعرّضت الأفراد لسوائل الجسم من الثدييات. على العكس من ذلك، لا يقوم الدجاج بتصنيع هذا الأنزيم، وبالتالي هناك احتمالية منخفضة لحدوث ردّ فعل مناعي تجاه البروتينات الصيدلانية المنتجة في البيض. من الواضح أنّ استخدام البويضة كمفاعل حيوي قد توسّع بسبب التطوّرات في المعالجة الجينية، عن طريق الحقن المجهري للحمض النووي، ونقل الجينات عبر ناقلات الفيروسات القهقرية والفيروسات البطيئة، وإنشاء كائنات كيميرا باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية للكتاكيت، أو الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs). تمكين إنتاج مستحضرات صيدلانية حيوية مستقرّة، وذات خصائص جيّدة، وذات إنتاجية عالية في بياض البيض.
أثناء عملية وضع البيض، يكتسب كلّ صفار إباضة طبقات من بياض البيض في البداية، ثم أغشية القشرة، وأخيراً قشرة أثناء إنتقاله عبر قناة البيض البالغة، والتي يتراوح طولها بين 50 و70 سم. عادة، يشكّل الجزء الأبيض 60٪ من إجمالي وزن البيضة، مع بروتين الزلال الذي يشكّل المكوّن الأساسي لبياض البيض. تتمّ ترجمة الجينات التي ترمز لبروتينات بياض البيض في الخلايا الإفرازية لأكبر قناة بيض الدجاجة البياضة. عندما ينزل الصفار إلى قناة البيض، يتمّ تحفيز الإفراز. يمكن نقل الإنتاج المعدّل وراثيًّاً إلى البروتينات العلاجية في بياض البيض، عن طريق التعبير عن تسلسل يشفّر البروتين العلاجي من خلال التسلسل التنظيمي للجينات التي تشفّر بروتينات بياض البيض. الألبومين البيضاوي والليزوزيم، وهما جينان من بروتين بياض البيض، تمّ وصف تسلسلهما التنظيمي بدقّة على المستوى الجزيئي.
أبرز جينتَين مرشّحتَين للتحرير من أجل تكييف التعبير مع قناة البيض. يقوم جين الألبومين البيضوي بتشفير البروتين الذي يشكّل أكثر من نصف بياض البيضة، ويتمّ التعبير عنه فقط في خلايا الغدّة الأنبوبية لقناة البيض. إنّ تطوّر الدجاج المعدّل وراثيًّا الذي ينتج بروتيناً صيدلانيًّا مؤتلفاً وظيفيًّا، بكمّية عالية على وجه التحديد في قناة البيض للدجاج البياض كعنصر من مكوّنات بياض البيض، مع عدم وجود إشارة إلى أيّ إسكات للجينات بعد انتقال خط الجراثيم. من ناحية أخرى، يتمّ التعبير عن الليزوزيم في بلاعم الدجاج وقناة البيض. كشفت العديد من الدراسات عن تطوّر جينات خيالية مكوّنة من تسلسلات تنظيمية لجين الليزوزيم في الدجاج، وتسلسلات تشفّر البروتينات الصيدلانية الأجنبية التي يمكن إدخالها بشكل عشوائي في جينوم الدجاج، والحفاظ على أنماط التعبير الكافية. تمّ اكتشاف العديد من البروتينات البشرية المؤتلفة التي تشتمل على الإنترفيرون البشري ألفا-2ب وبيتا-1أ، بالإضافة إلى عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحبّبة البشرية.
كما تمّ الإبلاغ عن إنتاج أجسام مضادة علاجية، ومضادة للسرطان، وذات قدرات مفاعل (Fc) المحسَّنة بواسطة أنظمة المفاعلات الحيوية للدجاج المعدّلة وراثيًّا. علاوة على ذلك، تمّ مؤخّراً تصنيع الليباز حمض الليزوزومي، وتنقيته من بياض بيض الدجاج المعدّل وراثيًّا، باستخدام نمط (N-glycosylation) المميّز لبروتين بياض البيض. ومن المثير للإهتمام أنّ كانوما، أول بروتين دوائي تمّ ترخيصه مؤخّراً لعلاج الليباز حمض الليزوزومي.
وبالمثل، تمّ أيضاً إنتاج لقاح الإنفلونزا البشرية بواسطة مفاعلات حيوية للطيور. فالجدير بالذكر أنّ تنقية الأجسام المضادة البشرية وحيدة النسيلة من الدجاج، يبدو أنّه تطبيق فعّال تمّت مراجعته في مكان آخر. حاليًّا، يعدّ (OmniChicken)، الذي طوّرته شركة (Ligand Pharmaceuticals Inc)، هو عبارة عن منصّة فريدة من نوعها في جميع أنحاء العالم، تستخدم الدجاج المعدّل وراثيًّا لتوليد أجسام مضادة بشرية وحيدة النسيلة. أظهرت دراسات مختلفة أنّ بياض البيض ينتج منشّط البلازمينوجين الأنسجة للأدوية المضادة للتخثر، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة لعلاج سرطان الثدي، وببتيدات الحاتمة لحبوب اللقاح، والببتيدات المضادة للميكروبات. بالإضافة إلى ذلك، تمّ أيضاً توفير الإريثروبويتين البشري، وهرمون الغدّة الدرقية، ومنتجات حيوية أخرى بواسطة المفاعلات الحيوية للدجاج. ومن المتوقّع أن تصبح العديد من الخيارات لتنفيذ إنتاج البروتينات العلاجية في بيض الدجاج متاحة بسبب تعدّد استخدامات تحرير الجينوم.
هندسة الجينوم للخلايا الجرثومية للدجاج
لقد زادت في الآونة الأخيرة فعّالية تحرير الجينوم لإنشاء مفاعلات حيوية قوية للدجاج، وذلك بسبب عدد من التطوّرات التكنولوجية، التي أدّت إلى تطوير سلالات دجاج معدّلة وراثيًّا. تشمل هذه التطوّرات تحسين ظروف استزراع الخلايا الجرثومية الجرثومية للدجاج، وتوليد مضيفات بديلة معقّمة من الدجاج، وتقنيات جديدة لتحرير الجينات بكفاءة وتركيز. الخلايا الجرثومية الأولية هي خلايا جذعية أحادية القدرة، تتمايز في النهاية إلى أمشاج، أو حيوانات منوية، أو بويضات، والتي لديها القدرة على نقل المعلومات الوراثية إلى الأجيال اللاّحقة. أثناء التطوّر الجنيني، تكشف الخلايا الجرثومية الأولية عن قدرات خاصّة على الانتقال والهجرة، وبعد ذلك تملأ التلال البولية التناسلية للجنين 45. يمكن عزل الخلايا الجرثومية الأولية في الطيور في مراحل نمو مختلفة، بشكل رئيسي، من الجهاز الوعائي لأجنّة المرحلة 14-15 من (HH) مثل الخلايا الجرثومية الأولية المنتشرة (cPGCs)، ومن سلسلة التلال التناسلية من الأجنة (HH 29-31) مثل الخلايا الجرثومية التناسلية (gPGCs). يمكن إستخدام التقنيات التي تتوسّطها الأجسام المضادة على سطح الخلية، والطرد المركزي المتدرّج للكثافة، وتقنيات الفصل المعتمدة على الحجم لتحديد وتنقية (cPGCs) و(gPGCs) في الطيور. ومن المثير للإهتمام أنّ الدجاج هو أحد الأنواع القليلة التي تسمح بتكاثر الخلايا الجرثومية الأولية بسهولة في المختبر، لزيادة وفرة الخلايا عند تربيتها في وسط محدّد، حيث قد يصل نمو الخلايا الجرثومية الأولية في المختبر من جنين دجاج واحد إلى أكثر من 100000 خليّة بعد حوالي أربعة أسابيع.

في الطيور، يعتمد التحوير الجيني، وتحرير الجينوم على آلية نقل السلالة الجرثومية المميّزة التي تتضمّن الخلايا الجرثومية. يمكن تغيير الخلايا الجرثومية الجرثومية الأولية المستزرعة في المختبر عن طريق إدخال جين أجنبي معدّل وراثيًّا، أو إجراء تعديلات معيّنة على تحرير الجينوم، ثم حقنها ميكرويًّا في شرايين الدم للأجنّة المتلقّية في البيض ذي النوافذ بعد حوالي يومين من الحضانة، حيث تهاجر إلى الغدد التناسلية النامية. يتمّ إغلاق الأجنّة المتلقّية وحضنها حتى تفقس، ثم تتمّ تربية الدجاج المفقس النضج جنسيًّا، ويتمّ تهجينه مع الدجاج البرّي.
وباستخدام تقنيات تحرير الجينوم لتعديل سلالة الخلايا الجرثومية، يمكن نقل التركيب الجيني المتحوّل للحيوان إلى نسله. يتم بعد ذلك فحص نسل هذا التهجين لتحديد تلك المشتقّة من الخلايا الجرثومية الأولية المعدّلة وراثيًّا. مثل هذه الإستراتيجية لإنتاج الطيور المعدّلة وراثيًّا تمكِّن من إنتاج نماذج المفاعلات الحيوية، بالإضافة إلى نماذج الطيور الأخرى. سيؤدّي إستخدام هذه الطريقة إلى نسل يرث نصف كروموزوماته من الخلايا الجرثومية الأولية المانحة. حقيقة أنّ الخلايا الجرثومية الجرثومية المانحة المحقونة، والخلايا الجرثومية المضيفة الذاتية تتعايش في الغدد التناسلية الجنينية المضيفة، فقد تشكّل عيباً وذلك عن طريق تقليل إحتمالية إنتاج ذرية من التكاثر المتتالي من الخلايا الجرثومية الجرثومية المانحة. بالتالي، تهدف المبادرات الأخرى إلى بناء خيمر السلالة الجرثومية بشكل أكثر فعّالية، عن طريق تقليل أو إستنفاد الخلايا الجرثومية الأولية الذاتية في الجنين المضيف، باستخدام مجموعة متنوّعة من التقنيات، بما في ذلك العلاج الإشعاعي بأشعّة جاما.
أنظمة تحرير الجينوم القابلة للبرمجة
وباستخدام تقنيات تحرير الجينوم القابلة للبرمجة، يمكن تعديل الجينوم بطرق عدّة، وبدرجات متفاوتة، مع كونه فعّالاً ودقيقاً أيضاً. إنّ الخصائص البيولوجية، ومقاومة الأمراض، وإنشاء البروتينات الحيوية الوظيفية، كلّها تستفيد من طرق التربية الجديدة التي جلبتها هذه التقنيات. يتمّ إستخدام تحرير الجينوم لإضافة الجينات المطلوبة، وشظايا الحمض النووي، وبعد ذلك يتمّ تربية الحيوانات لتوليد خطوط مستقرّة. من أجل تقديم نظرة شاملة لأبحاث تغيير الجينوم الحالية في الطيور، سيكون من المفيد النظر إلى تقنيات تحرير الجينوم المختلفة المستخدمة في أنواع الطيور. كانت (ZNFs) أول أدوات تحرير الجينوم القابلة للبرمجة، والتي انضمّت إليها لاحقاً (TALENs)، وتقنية (CRISPR-Cas9 9. ZNFs) وهي عبارة عن بروتينات ربط الحمض النووي القابلة للبرمجة، ومرتبطة بأنزيمات نوكلياز الحمض النووي المخصّصة. عمليًّا، يمكن استهداف أي تسلسل من الإهتمام بواسطة (ZNFs) المهندسة.
يمكن إستخدام (ZNFs) لتحرير الخلايا المستنبتة، بما في ذلك الخلايا الجذعية، وهو أمر مهمّ جدًّا لتطوير أساليب تحرير جينوم الطيور. لم يتمّ نشر العديد من الدراسات حول تحرير جينوم (ZNF) للطيور حتى الآن. على الرغم من المنشورات السابقة التي تستخدم (ZNFs) لاستهداف الجينات المثيرة للاهتمام. مروحة وآخرون، حاولوا بناء (ZNF) ثنائي الأبعاد يتعرّف على تسلسل نيوكليوتيد في المنطقة غير المترجمة من ألبومين بيض الدجاج. على الرغم من أنّ التجميع يبدو لديه الخصائص المثالية، إلاّ أنّه فشل في إظهار أي نشاط نووي.
مهدت تكنولوجيا (ZNF) الطريق لمنصّات أكثر دقّة لتحرير الجينات، إلاّ أنّ التكلفة الصعبة والمكلفة لبناء مجالات البروتين خصّيصاً لكلّ موضع جينومي، بالإضافة إلى إحتمال حدوث إنقسام خاطئ في الحمض النووي المستهدف، الناجم عن تعديلات النوكليوتيدات المفردة، أو تفاعلات المجال غير المناسبة، قد ساهمت في بناء فرص كبيرة (معوقات هذه التكنولوجيا). المؤثّرات الشبيهة بمنشّط النسخ (TALEs) هي بروتينات تفرز، بشكل أساسي، عن طريق البكتيريا المسبّبة للأمراض النباتية من جنس (Xanthomonas)، وتتميّز بنطاقات ربط الحمض النووي التي تتكوّن من وحدات متكرّرة يبلغ طولها 33 إلى 35 حمضاً أمينيًّا، حيث تتعرّف كلّ وحدة على زوج قاعدة (DNA) واحد، يعتمد على على ثنائي الببتيد شديد التغيّر في الأحماض الأمينية 12 و13 المعروفة باسم بقايا ثنائي التكرار المتغيّر (RVD) التي تحدّد خصوصية ربط النوكليوتيدات لكلّ تكرار. يتمّ إنشاء (TALENs) عند دمج مجال إنقسام الحمض النووي غير المحدّد من نوكليازات (FokI) الداخلية في مجال ربط الحمض النووي المحدّد (TALEs)، ممّا يتيح توليد (DSB) عند (dimerization). أنشأت أول دجاجة معطّلة للجينات، باستخدام الضربة القاضية المستهدفة للجين، بوساطة (TALEN) لجين الألبومين البيضاوي في (PGCs)، وتمّ الحصول على ذرية متحوّلة لجين البيضاوي، باستخدام تحليل الاختبار المتقاطع، ممّا يشير إلى أنّ (TALEN ap) يعدّ النهج المستخدم في خط الخلايا الجرثومية الجرثومية للدجاج إستراتيجية فعّالة لإنشاء تحرير جينوم معيّن في الدجاج بأمان للتنفيذ المحتمل.
تمّ إستهداف الضربة القاضية لموضع (DDX4) بنجاح باستخدام (TALEN)، بالتزامن مع ناقل الإستهداف، والإبلاغ عن إنتقال سلالة جرثومية من الطيور المؤسِّسة. حاليًّا، أكثر أساليب تحرير الجينوم دقّة وعملية وفعّالية هي كريسبر وبروتين (Cas9) المصاحب له. يتكوّن نظام كريسبر-كاس9 من عنصرين أساسيين: نوكلياز داخلي محفز لـ (DSB)، (Cas9)، ودليل قصير مفرد (RNAs gRNA) مكمّل لمنطقة محدّدة من تسلسل الجينوم.
يعتمد التعرّف المحدّد بشكل كبير، على وجود نموذج مجاور للفاصل الأولي القصير (PAM) على كل جانب من الموقع المستهدف بعد التعرّف على الهدف، يتمّ تشغيل تكوين حلقة (R)، وانفصال الجديلة عن طريق مطابقة القواعد التكميلية بين (sgRNA)، والحمض النووي المستهدف، وتفاعلات (Cas9) مع (DNA)، والتغيّرات التوافقية ذات الصلة. تمّ توثيق نظام كريسبر-كاس9 ليتمّ تطبيقه على الخلايا والأنسجة الجسدية للطيور. تمّ أيضاً الإبلاغ عن استهداف الخلايا الجرثومية الأولية، بواسطة كريسبر-كاس9 واستغلال هذه الخلايا المعدّلة لإنشاء دجاج معدّل وراثيًّا، عن طريق إدخال تعديلات جينية محدّدة في الجينوم. يتم إصلاح DSBs الناتجة عن أدوات تحرير الجينوم عن طريق آليات إصلاح الحمض النووي بوساطة المضيف. يتمّ تشغيل عملية (NHEJ) الشائعة المعرّضة للخطأ، في حالة عدم وجود قالب إصلاح، ممّا يؤدّي إلى عمليات إندل متفرّقة، أو حتى بدائل في موقع (DSB)، والتي تؤثّر عادةً على وظيفة الجينات. يمكن تنشيط مسار (HDR) الخالي من الأخطاء في وجود قالب متبرّع به تسلسل مستهدف محاط بأذرع متماثلة لإحداث تباين مقصود، عن طريق إعادة التركيب المتماثل. وهذا يضع الأساس لإجراء تغيّر جيني دقيق، بما في ذلك، في كثير من الأحيان، إدخال الجينات، أو حذفها، أو تصحيحها، أو توليد الطفرات، ممّا يمكّن من إنشاء مفاعلات حيوية لإنتاج الأدوية - مفاعلات حيوية للدجاج، ونماذج الطيور الأخرى.
طرق تحرير الجينوم العلاجي
توفّر أدوات تحرير الجينات إمكانية تمكين مرونة ملحوظة في تعديل الجينوم في مواقع محدّدة لإلغاء الجينات، أو إعادتها إلى وضعها الطبيعي، أو إدخال جينات محوَّرة علاجية، أو إصلاح الطفرات المرتبطة بالحالات الوراثية. لا يزال الافتقار إلى تقنيات آمنة، وفعّالة لإدارة كواشف التحرير الجيني يشكّل عائقاً كبيراً أمام التحرير الجيني العلاجي. أنتج التحوير الجيني المعتمد على تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف أدوية جديدة، وأتاح آفاقاً جديدة لإثراء الثروة الحيوانية. من بين الأهداف الرئيسية لعملية نقل الجينات، هو إنشاء مفاعلات حيوية أو كائنات حيّة ذات ميزات مربحة لا يمكن تحقيقها باستخدام الطرق التقليدية. والجدير بالذكر أنّ دمج الجينات المحوَّرة في الجينوم المضيف في الخلايا حقيقية النواة أمر ضروري للانتقال المستقرّ، والتعبير عن الجينات المحوَّرة. يمكن نقل الخلايا حقيقية النواة بواسطة الحمض النووي المؤتلف الخارجي بطرق عدّة.
يعدّ التثقيب الكهربائي طريقة أخرى لإدخال الحمض النووي المؤتلف في أجنّة الدجاج. هذه التقنيات، وإن كانت مفيدة لدراسات التعبير الجيني القصيرة المدى، إلاَّ أنها أقل فعّالية في توصيل الحمض النووي المؤتلف مباشرة إلى أجنّة الدجاج من أجل إنتاج حيوانات ذات جينات محوَّرة وراثيًّا. يعدّ نشر البلازميد الذي يشفّر بروتين (Cas9) و(sgRNA) استراتيجية شائعة. تمّ إستخدام عملية إزالة الدهون، والبولي إيثيلين أمين، والكهرباء لإدخال البلازميدات التي تحتوي على بروتين (Cas9)، وتسلسل (sgRN). في العمل الأوّل الذي يستخدم نظام كريسبر-كاس9 في الدجاج، تمّ إلكتروبورات الأجنّة بالبلازميدات التي تعبّر عن (Cas9) و(sgRNAs) الموجّهة ضد عامل النسخ (PAX7). يبدو أنّ هناك طريقة عملية أخرى لمعالجة جينوم الطيور، وهي توصيل الحمض النووي عن طريق الحيوانات المنوية. تمّ تطبيق التلقيح الإصطناعي لتوصيل ناقلات تحرير الجينات، عبر الحيوانات المنوية المنقولة التي تمّ الحصول عليها بعد إدخال (Cas9 mRNA) و(sgRNA) في الخلايا باستخدام عملية شفط الدهون. حتى الآن، أثبتت النواقل الفيروسية فعّاليتها بشكل ملحوظ في توصيل الجينات المحوَّرة.
النظرة المستقبلية
عن طريق تعديل الجينوم الفيروسي، والذي يتضمّن المكوّنات الرئيسية اللاّزمة لتوصيل المواد الوراثية إلى الخلايا، يتمّ إستبدال العناصر غير المطلوبة للدمج بالجينات المحوَّرة أثناء بناء الناقلات. عندما يغزو الجينوم الفيروسي الخلية المضيفة أثناء العدوى، يبدأ التعبير عن الجينات الفيروسية. تعدّ نواقل الفيروسات البطيئة، والفيروسات الغدانية، والفيروسات الغدانية المرتبطة بها (AAV)، الأنواع الثلاثة الرئيسية من النواقل الفيروسية المستخدمة في نقل الجينات. أظهرت العديد من التحقيقات أنّ كريسبر-كاس9 يتمّ تسليمه، بشكل فعّال، بواسطة الفيروسات الغدّية لتحريره. ومع ذلك، نظراً للقيود المرتبطة بمناعتها، تُستخدم الفيروسات الغدّية حاليًّا، فقط في إعدادات البحث. يشتمل النهج الأكثر إستخداماً لاستهداف الجينات بوساطة (CRISPR-Cas9) على نظام (AAV) مزدوج لتقديم (Cas9) و(sgRNA) وقالب المانح. تمّ استخدام تقنية (CRISPR-Cas9) بوساطة (AAV) بنجاح في العديد من التحقيقات قبل السريرية لتعديل الجينات. نظراً لكون النواقل الفيروسية معيبة في التكاثر، فهي آمنة، وأغلبها متاحة بسهولة في التجارة. نظراً لإمكانية الوصول إلى المنهجيات الراسخة وفعّالية النقل العالية، تمّ إستخدام نواقل التوصيل الفيروسية لنقل الأحماض النووية إلى الخلايا، وهي تقنية التوصيل المفضلة لـ (CRISPR-Cas9). تمّ إستخدام ناقلات (Lentiviral) بنجاح بواسطة (Kwon et al)، وغيرها من الهيئات البحثية لنقل الخلايا الجنينية للدجاج، ممّا أدّى إلى إنشاء خطوط محوَّرة وراثيًّا بشكل فعّال. أحد الأشكال البديلة لتكنولوجيا توصيل الجينات التي تُستخدم بشكل متكرّر في أبحاث الجينات المحوَّرة هي النواقل القائمة على الترانسبوزونات، بما في ذلك نواقل (PiggyBac) التي تتميّز ببساطة التصنيع، وسعة الشحن الكبيرة. لقد ثبت أنّ نواقل (PiggyBac) تنتقل، بشكل فعّال، إلى جينومات كلّ من أجنّة الدجاج، والخلايا الجرثومية الأولية. هناك تقنية شائعة أخرى تعتمد على الترانسبوزون غير الفيروسي، لتوصيل الجينات لزيادة كفاءة إنتاج طيور محوَّرة وراثيًّا ومستقرّة، وهي ناقل (Tol2). يعدّ التسريب المباشر لنواقل ترانسبوزون (Tol2) في الأوعية الدموية للأجنّة المبكرة لاستهداف الخلايا الجرثومية أثناء هجرتها عبر الدورة الدموية، إحدى الطرق لإنتاج طيور معدّلة وراثيًّا، تعبّر عن جين مراسل محمول في الترانسبوزون. لقد تمّ عرض إستخدام ناقلات النقل (Tol2) بواسطة (Macdonald et al)، وذلك لتحسين فعّالية التعديل الوراثي المستقرّ للخلايا الجرثومية الأولية بشكل كبير، ممّا يتيح تطبيق التعديلات الجينية للخلايا الجرثومية الأولية كاستراتيجية لإنتاج الدجاج المحوّر وراثيًّا.
ولتلبية المتطلّبات الإنسانية، قام قطاع المستحضرات الصيدلانية الحيوية بتغيير أساليب عمله التقليدية. نظراً لفعّالية المنتج النهائي في السنوات الأخيرة، إكتسبت القطع المعدّلة وراثيًّا التي يمكن إستخدامها كمرافق للتصنيع الحيوي الطبيعي لقطاع الأدوية إهتماماً قويًّا، خاصّة مع النمو المستمرّ للمعرفة التقنية، والقدرة على إنتاج كمّيات كبيرة من البروتين في بياض البيض بشكل مستمرّ وغير جراحي. إنّ إستخدام الدجاج كمفاعل حيوي قد يكون له تأثير كبير على صحّة الإنسان، من خلال تقديم خيارات علاجية بديلة. هناك حاجة الآن إلى مبادرات الصيدلة الحيوية للدواجن لتحويل الدجاج إلى منتج دوائي واسع النطاق.
منصّات المفاعلات الحيوية التي يمكنها تلبية الطلب المتزايد على العلاجات البشرية القائمة على البروتينات المؤتلفة. إنّ القدرة على التعديل الوراثي للحيوانات، من خلال استخدام التقنيات الوراثية المتقدّمة، تفتح فرصاً جديدة لبرامج التربية لإنتاج حيوانات المستقبل بشكل فعّال، بما في ذلك الدجاج الذي يعمل كمصانع أدوية صغيرة. توفّر هندسة الجينوم، بالتعاون مع الخلايا الجرثومية الأولية والتقنيات المعدّلة وراثيًّا، إمكانية تحسين برامج التربية التي تركّز على زيادة كفاءة الإنتاج، وتطوير منتجات حيوانية جديدة. تتمتّع التقنيات المعدّلة وراثيًّا بالقدرة على مواءمة نموذج الدجاج المعدّل وراثيًّا مع نماذج الثدييات المعدّلة وراثيًّا الأكثر إستخداماً على نطاق واسع، بل وتجاوزها. لقد نما الدجاج الآن، باعتباره منصّة نموذجية مهمّة لعلم الصيدلة، ومجالات أخرى من الزراعة وعلم الأحياء. وكانت إدارة الغذاء والدواء الأميركية قد وافقت بالفعل على إستخدام الدجاج المعدّل وراثيًّا في عام 2015، كمفاعل حيوي لتصنيع الأدوية القائمة على البروتين في البيض. ومن الناحية الفنية، فإنّ العقبات الرئيسية التي تحول دون الاستفادة الكاملة من هذه التقنيات، هي الافتقار إلى خيارات السكن للطيور التجريبية، وصعوبة الحفاظ على خطوط قيّمة معدّلة وراثيًّا لإنتاج الأجنّة التجريبية مع مرور الوقت. يتطلّب البرنامج الشامل لإنتاج الدواجن المعدّلة وراثيًّا إستثماراً كبيراً في البنية التحتية الحيوانية، والمختبرية للتربية بعد جيل الطيور المؤسّسة، وصيانة الخطوط المحوَّرة وراثيًّا. من المتوقّع أن تؤدّي الأبحاث المستقبلية إلى إنشاء تقنيات معدّلة وراثيًّا متطوّرة تستفيد، بشكل كامل، وتحسّن مزايا نماذج الطيور للبحث الأساسي والتطبيقي. إنّ إستهداف الخلايا الجرثومية الأولية، بإستخدام أنظمة تحرير الجينوم القابلة للبرمجة، له تأثير كبير على نماذج الطيور. سيكون لدى البشر خيارات، وفوائد أكثر بكثير، إذا تمّ إستغلال تكنولوجيا تحرير الجينات على نطاق واسع على أنواع الطيور، وتمّ إعتمادها في صناعة التربية.